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液相色谱仪在测定白肋烟烟叶游离氨基酸含量中的应用

发布时间:2011/3/1 9:33:21阅读人数:1189

11 仪器 、试剂和材料

111    高效液相色谱仪系统包括 Water515 Waters 2475荧光 检测器 Empower色谱工作站,Rheodyne 7725 i型手动进样 阀.Sigma 3 K 18高速离心机.超声波振荡器(KQ-250 E型,昆山,混合器(CAT1431,日本

112 试剂  标准样品 :天冬氨酸 (Asp)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸 (His)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、胱 (cys2)、酪 (Tyr)、缬 (Va1)、蛋 (Met)、赖 (Lys)、异亮 (Ile)、亮氨 (Leu)、苯丙 氨酸 (Phe),均 为色谱纯 ,美 SIGMA公司 L一正缬氨酸 ,色谱纯,医药.3一巯基丙酸色谱纯盐酸 、醋酸钠 、硼酸钠 、氢氧化钠、三乙胺均为分析纯,甲醇、四氢呋喃、乙腈、醋酸均为色谱纯,水为超纯水.

113 材料 中二级 白肋烟叶

12 色谱条件

色谱柱 :依 利特 c 。柱 (46 mm id.×250mm5  m)流动相 A(1247±0025)g醋酸钠 ,溶于适量纯水 ,加 100 wL三乙胺,用体积分数为 1 醋酸调 pH 720±005,再加入 15 mL四氢呋喃,混合均匀 ,定溶至 500 mL后用045 m的滤膜过滤后备用.流动相 B(2520±0025)g醋酸钠 ,加入 200 mL纯水溶解 ,用体积分数为 1%醋酸调 pH值至 720±005,加到400 mL乙腈和400mL甲醇的混合物中,混合均匀后用045 m的滤膜过滤后备用.流速 10 mL·min~.柱温 40℃. 检测器 :荧光检测器 ,激发波长 350 Hi,发射波长450 nm.进样量:20 wL.淋洗梯度如表 113 衍生化试剂的配制 称取邻苯二 甲醛 5 mg 2 mL的小瓶 中,加入 01 mL的甲醇,然后再加入 01 moL·L  的缓冲 溶液 1 mL,震荡使其溶解后加入 20 L 3一巯基 丙酸,震荡均匀后储藏与2 oC的冰箱中待用.

14 样品的前处理

称取粉碎后的烟末 20 g,放入 50 mL的容量 瓶中,加入 5 mL 01 mol·L  HC1 02 mL 1016 mg·L L一正缬氨酸溶液内标,定容 后用超声波萃取 20 min,然后在高速离心机上以 12 000 r·min 的转速离心 20 min,上清液用干燥 过滤器经 045  m微膜过滤.再用微 量吸取器吸 25  L硼酸缓冲液加入 1 mL衍生管 中,再吸取 5  OPA试剂加入衍生管中,然后吸取样品过滤过的样品液 10 L,在混合器混合均匀,吸取 5 L

3MPA试剂,再在 混合 器上 混合 匀,放 10 minflp可进样.

15 氨基酸的定性和定量分析

用标样色谱图、文献参照和标样加入的方法, 通过对照保留时间进行定性 ,对氨基酸的出峰顺序 加以确认 ;采用 内标法进行定量分析.即先根据氨 基酸标样与内标物色谱峰的峰 面积之 比与相应的 氨基酸浓度制作各氨基酸的工作曲线,求出相应的 线性方程 ,然后 由待测样品中各氨基酸与内标的色 谱峰峰面积之比,求出相应氨基酸的含量.3  小结 白肋烟叶样品 17种氨基酸测定 的变异系数为

232 -924%,标准回收率为 95..3 1007%.说 明该方法精密度和准确度较高,而且该方法具有检测 速度快、分离效果好、样品需求量少 ,样品制备程序简单、人为因素影响少等优点,适于推广应用.本企业公司:www.hzrush.comwww.jxsxgs.com

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