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首页 > 新闻中心 > 提高HPLC检测灵敏度的新方法摘要建立了不同固定相导致速度差实现堆积的理论模型，并以2一硝基酚，对羟基苯甲酸甲酯和3一硝基酚为模型化合物，进行了堆积现象研究。结果表明，不同固定相导致的速度差能实现堆积，进而显著提高HPLC的检测灵敏度。在本文考察的*佳堆积条件下，2一硝基酚，对羟基苯甲酸甲酯和3一硝基酚的检出限分别降低了4.5，5.0和9.1倍。
前言：
HPLC是一种广泛应用的分离分析手段，在环境分析，食品分析，蛋白质组学，药物代谢和药物动力学等研究中都有应用。检测灵敏度一直吸引着众多研究的关注。峰压缩可以提供更尖更细的峰，因此可以增加信噪比，灵敏度，改善分离能力。关于HPLC中的峰压缩现象也有一些报道。同时，在HPLC中也有不同固定相组合的应用，称二维或多维液相。二维和多维液相中，固定相的组合大多通过阀切换技术实现。可以实现复杂体系的分离分析。该方法的应用也可以实现复杂混合物体系，简单样品前处理方法，进行在线固相萃取等处理，实现体系中化合物的检测。还有一些报道把相同的色谱柱串联可以改善分离能力。本文将建立不同固定相导致速度差产生堆积的理论模型，并以3一硝基酚，2一硝基酚，对羟基苯甲酸甲酯为模型化合物，进行堆积现象的考察。
1、理论模型：
同一化合物在不同的固定相中移动速度不同。化合物在种固定相中移动的快，在第二种固定相中移动的速度慢，这样当化合物从移动速度快的固定相进入移动速度陧的固定相中会实现堆积。该堆积现象的示意图如下图所示
图1不同固定相导致速度差进行堆积前
（a）后（b）示意图
其中，峰压缩因子可表示为：g=Ckl／k2，
其中，当色谱柱体系确定，洗脱条件一定时，C为常数。
由以上关系式可见化合物在两种固定相中的移动速度差别越大，峰压缩因子越小，峰压缩越明显。
2、实验部分
2.1 仪器
Agilent1100系列：四元泵（带真空脱气机），自动进样器，柱温箱，AgilentVWD紫外检测器。色谱柱：苯基柱：4．6×250mm；C18柱：4．6×80mm流速：0．6ml／min，检测波长：254nm，柱温25℃。
2.2 试剂和药品
色谱纯的甲醇、乙腈，均为Fisher公司产品；实验用水为18．2M三蒸水。3一硝基酚，2一硝基酚，对羟基苯甲酸甲酯均为分析纯。
2.3 实验方法
1．分别测定化合物在不同固定相中，不同流动相组成时的色谱保留行为
2．根据上述实验结果，确定双柱体系的固定相类型和组合方式
3．选择不同的速度差考察化合物色谱行为的变化
2.4 标准溶液的配制
3一硝基酚，2一硝基酚，对羟基苯甲酸甲酯分别用1：1甲醇／水（V／V）配成浓度为1．44，0．095，1．46mg／ml的溶液，使用时逐级稀释。进样时的浓度分别为3一硝基酚，2一硝基酚，对羟基苯甲酸甲酯0.0072mg／ml，0．0095mg／mL，0．00292mg／ml。
3、结果与讨论
3.13 一硝基酚，2一硝基酚。对羟基苯甲酸甲酯在苯基柱和ESAC18柱中的色谱保留行为在较宽变化范围内，考察了流动相组成对化合物保留的影响。分别考察了3一硝基酚、2一硝基酚和对羟基苯甲酸甲酯在在苯基柱和ESAC18柱中的色谱保留行为。各条件下的logk与流动相组成的关系见表1。由表可见，随着流动相中乙腈百分含量的增加，logk明显增加，且两者的增加呈线性相关。在实验考察范围内，各条件下的logk与流动相组成的关系均符合容量因子与二元流动相组成之间的关系。
表13一硝基酚、对羟基苯甲酸甲酯、
2一硝基酚logk与流动相组成的关系
3.23 一硝基酚，一硝基酚。对羟基苯甲酸甲酯在苯基柱和ESAC18柱中的移动速度为了确定能产生速度差从而实现堆积的固定相组合，进一步表征了3一硝基酚，2一硝基酚和对羟基苯甲酸甲酯在苯基柱和ESAC18柱中移动速度与流动相组成的关系，结果如图2所示。由图2可明显看出，相同流动相组成条件下，3一硝基酚，2一硝基酚和对羟基苯甲酸甲酯在苯基柱中的移动速度大于在C18中的移动速度。因此可以确定这三个化合物可实现堆积的体系分别为苯基柱一C18柱体系。
3.3 速度差对堆积的影响
图3为容量因子表示的速度差与堆积因子的关系。由图可见，在苯基柱一C18柱体系中，2一硝基酚、对羟基苯甲酸甲酯、3一硝基酚均可实现堆积，且堆积因子与速度差线性相关。速度差越大，即kl／k2值越小，堆积因子越小，堆积得越好。
结果表明，2一硝基酚、对羟基苯甲酸甲酯、3一硝基酚在苯基柱一C18柱体系中可以实现堆积，并且洗脱条件一定时，速度差越大堆积程度越好。也就是说，能否实现堆积前提条件是化合物在这两种固定相中是否存在速度差。同一洗脱条件下，堆积程度的好坏与速度差的大小相关，速度差越大，堆积越明显。而与化合物的其它性质无关。
图2 2一硝基酚、对羟基苯甲酸甲酯、3一硝基酚在苯基柱
中的移动速度大于在C1 8柱中的移动速度。
图32一硝基酚、
对羟基苯甲酸甲酯、3一硝基酚移动速度
差（kl／k2）与堆积因子的关系。检测波长：254nm．流速：
0．6ml／min；堆积体系：苯基柱一C18柱体系。
图4 对羟基苯甲酸甲酯堆积前
（1】以及*佳堆积条件下（2）的色谱图。
检测波长：254nm。流速：0．6mI／min。1：流动相：
3％乙腈／97％水。等度洗脱；固定相：苯基柱2：流动相：
Omin-38．4min：3％乙腈／97％水：38．4min-38．5min：3％
乙腈／97％水-45％乙腈／55％水；38．5min一53min：45％乙
腈／55％水。固定相：苯基柱一C18
3.4 *佳堆积条件以及*佳堆积条件下的色谱图
选实验条件下，各模型化合物在相应的柱体系中均可实现堆积。图4是对羟基苯甲酸甲酯堆积前以及*佳堆积条件下的色谱图。从图中可看出与堆积前相比，堆积后保留时间明显增加，峰高明显增加，峰宽明显变窄，实现堆积后灵敏度明显增加。2一硝基酚和3一硝基酚堆积前后也可观察到类似现象。
3.5 *佳堆积条件下的精密度
考察了*佳堆积条件下，各堆积体系保留时间，峰面积，峰高，峰宽，的精密度。结果表明，*佳堆积条件下，各物质在相应的堆积体系中的精密度均小于5％。说明该方法重现性好，稳定性好。
3.6 堆积前后检出限的变化
限的高低可以表征检测灵敏度的高低，检出限越低，检测灵敏度越高。分别考察了2一硝基酚、对羟基苯甲酸甲酯、3一硝基酚在堆积前以及在苯基柱一C18柱堆积体系下*佳堆积条件下，各物质相应的检出限，结果列于表2
表2 堆积前和*佳堆积条件下的检出限（S／N=3，mg/mL）
4、结论
建立了不同固定相导致的速度差实现堆积的理论模型，并进行了验证和应用。由固定相不同引起的速度差可以导致在线堆积，堆积程度与速度差的大小有关，速度差越大堆积得越好。分别以3一硝基酚，2一硝基酚，对羟基苯基酸甲酯在苯基柱一C18堆积体系的堆积为模型，实验结果与理论模型一致。该堆积现象可明显提高检测灵敏度，在实验所得的*佳堆积条件下，检出限降低了4-9倍。该结果表明，对于任何化合物只要选择合适的柱体系和洗脱条件，都可实现提高检测灵敏度，降低检出限的目的。