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植物花色苷定性定量研究方法

发布时间:2011/5/30 9:57:23阅读人数:1670

摘要:植物组织中是否有花色苷及其类型 ,可通过植物组织的颜色、 抽提液的颜色、 抽提液在 pH梯度中的颜色,根据高效液相色谱仪的研究方法等作大致的推断 ,但对植物组织中的花色苷进行较精确的定性还需做进一步分离、 纯化和鉴定.定量分析要依据材料不同而选择不同的方法 ,本文对花色普定性定量研究方法进行了综述.
花色苷是一种黄酮类色素 ,存在于大部分的花和果实中 ,一些植物的茎和叶中也存在花色苷.花色苷作
为一种天然食用色素 ,安全、 无毒、 且具有一定的营养和药理作用 ,在一些功能性食品和化妆品中已有应用,
因此越来越受到人们的重视[ 1, 2 ]
.花色苷是由花色素和糖结合形成的配糖体 ,常见的花色素主要有 6种 ,分
别是天葵色素 (花葵素 )、 矢车菊素、 飞燕草色素 (翠雀素 )、 芍药色素、 牵牛花色素和锦葵色素 (二甲花翠
素 )
[ 3 ]
.花色苷的种类决定于花色素的种类、 糖基的种类以及花色素与糖基的结合部位.本文对花色苷定性
定量的方法进行了概述 ,以方便对植物的花色苷进行较为广泛和深入的研究 ,从而为进一步研究花色苷的性
质奠定基础.
1  花色苷的简单定性
可根据植物体的颜色判断.当植物组织呈现有蓝色或紫色时 ,其肯定含有花色素;呈红色时,则可能含有
花色素也可能含有类胡萝卜素 ,这时可根据水溶性来区别 ,花色素类较易溶于水而类胡萝卜素不易溶于
水[ 2 ]
.若将含有花色素的植物体的切片暴露于醋酸蒸汽中会变成红色 ,而暴露于氨蒸汽中时 ,会依紫— 蓝 —
绿的顺序发生颜色变化[ 2 ]
.花色苷的颜色会随溶液 pH的变化而变化 ,花色苷在强酸性溶液中呈稳定的红
色 ,弱酸性至中性溶液中呈红紫色 ,碱性溶液中呈蓝色.主要含有天竺葵色素、 矢车菊素的糖苷提取物会呈现
橙到红色 ,含有甲基花青素糖苷的为深红 ,含有飞燕草素、 矮牵牛苷配基和锦葵色素糖苷的则会显出红色 ,而
糖苷基团的酰化可能会有一种蓝化效果[ 3 ]
.花色苷的酰基化会影响花色苷的稳定性.非酰化和单酰化的花
色苷在 pH值很低时 ,其溶液呈现*强的红色.随着 pH值的增大 ,花色苷的颜色将褪至无色 ,*后在高 pH值
时变成紫色或蓝色.但是具有两个或两个以上酰基的花色苷在整个 pH值范围内都表现出相当好的颜色稳
定性[ 4 ]
.将植物组织用石油醚提取 ,若无色则说明提取物不含类胡萝卜素和叶绿素;向提取物中加入 10%
HCl若呈现各种红色且加入 25%氨溶液后呈现各种黄绿 (花色苷的蓝色与类黄酮的黄色产生 )则说明含有
花色苷和类黄酮 (除去橙酮 )
 2  花色苷的提取
花色苷提取方法的选择取决于提取的目的和花色苷的种类.多用盐酸甲醇溶液或蚁酸甲醇液提取[ 7 ]
.
定量提取需在低温下保持一夜 ,若浑浊还需过滤或离心分离;若只用于层析的样品 ,则提取 10 - 15 min即
可[ 8 ]
.当提取的花色苷要用于食品着色时 ,考虑到甲醇的毒性 ,应选择盐酸乙醇溶液。
提取花色苷时用盐酸酸化可以保持低 pH值,阻止无酰基的花色苷的降解,但随着盐酸甲醇液或蚁酸甲醇
液的蒸发盐酸被浓缩其结果会导致花色苷的降解. Revilla等对红葡萄中色素进行提取的研究表明提取液中盐
酸的浓度大于 0 . 12 mol /L就会引起含酰基的花色苷的部分水解[ 9 ]
.因此为了获得更接近于天然状态的花色苷,
可采用中性溶剂或弱有机酸做初步提取.如果既要考虑色素的产量,又要尽量保持色素的原始状态,可以选择
有机酸和甲醇提取花色苷,其中,柠檬酸是的,其次是酒石酸、 甲酸、 乙酸和丙酸.一些学者采用丙酮作提取
剂,其效果比酸化的甲醇液要好,且操作可在相对较低的温度下进行[ 7 ]
.初步提取的花色苷提取物通常很稀,一
般用旋转蒸发器浓缩.因花色素类不耐高温,所以浓缩时温度不要超过 40℃,时间也不宜太久.
3  花色苷的分离纯化
3 . 1  纸层析
是分离天然色素的一种较为传统的方法 ,具有快速、 设备简便等优点 ,但此法分离到的花色苷的量很有
限.常用新华 NO. 3或 What manNO. 3层析纸 ,多以 BAW (正丁醇 -醋酸 -水 = 4∶ 1∶ 2 v/v)、 MAW (正丁醇 -
醋酸 -水 = 4∶ 1∶ 5v/v)为展液.大规模分离 (1 - 100mg)时常用 BH (正丁醇 - 2mol /L盐酸 = 1∶ 1上层 v/v)和
15%的乙酸为展液.展开后 ,用酸性甲醇或乙醇洗涤 ,乙醚反复沉淀、 浓缩 ,即可得到样品[ 2, 8 ]
.
3 . 2  薄层层析
可用硅胶作吸附剂 , Harbon的研究表明以乙酸乙酯 -甲酸 - 2mol /L盐酸 ( 86∶ 5∶ 9)为展液尤适用于分
离用纸层析很难分离的锦葵色素和芍药色素[ 8, 10 ]
.也可用纤维素作吸附剂.具有速度快、 分辨力好的优点 ,但
同纸层析法一样 ,此法分离到的花色苷的量也很有限.
3 . 3  柱层析
是日前普遍采用的纯化花色苷的方法 ,对于不挥发的花色苷的分离是理想的;多以吸附树脂、 凝胶为吸
附剂.在游离花色素的情况下 ,洗脱速度取决于游离酚羟基对氢键的利用程度 ,依次为:锦葵素 >芍药素 >天
竺葵素 >碧冬茄素 >矢车菊素 >飞燕草素。
3 . 4 HPLC (高效液相色谱 )
可用制备型 HPLC (p reparative HPLC)来纯化花色苷. Fi orini用 Sphefis orb ODS - 2柱对草莓、 接骨木、 茄
子、 萝卜等的花色苷进行了提取 ,结果表明 HPLC是分离单糖基或酰化的二糖基和三糖基花色苷的一种有效
的方法[ 11 ]
. 近来 ,科学工作者多用高效快速、 样品用量极少、 溶剂消耗极少的毛细管电泳 (CE) , 1997年
B ridle用毛细管区带电泳 (CZE)使得混有草莓和接骨木浆果花色苷获得了分离. 1998年 Watanabe用胶束电
动毛细管色谱法 (MEKC /MECC)分析了糖果、 果汁、 果冻等食品中的接骨木色素 ,不到 10 min所有的花色苷
都得到分离[ 12 ]
.
4  花色苷的定性分析
4 . 1  纸层析与薄层层析
常用的展开剂有 BAW (正丁醇 -乙酸 -水 = 4∶ 1∶ 5v/v/v)、 BH (正丁醇 - 2mol /L盐酸 = 1∶ 1)、 1%盐酸
(浓盐酸 -水 = 3∶ 97)等.可通过各种花色苷在纸层析与薄层层析中的 Rf值来推断花色苷的种类.各种花色
苷的 Rf值可参考文献[ 2, 6, 13 ]
等得到.纸层析与薄层层析用于花色苷的定性分析很有限且缺乏精确性.
4 . 2  紫外 -可见光谱法
通常用 0 . 01%的盐酸甲醇液作为溶剂测定其紫外吸收值 (也可用 0 . 01%的盐酸乙醇 ) .花色苷及其色
素元在可见光 465 - 550 nm,紫外光 275 nm处有吸收峰 ,不过通常提取物要在 200 - 700 nm范围扫描 ,与酰
基化有关[ 3 ]
.在 0 . 01%的盐酸乙醇测定的λ max要比在 0 . 01%的盐酸甲醇中的λ max长 10 nm,在 0 . 01%的
盐酸甲醇中的λ max比在水中的λ max长 15 nm.
用紫外 -可见光谱法测定花色苷其要点如下:
①B环有邻位羟基的确定   将花色苷及其色素元在 200 - 700 nm波长范围内进行扫描.再加入 AlCl 3 ,
若出现红移说明 B环有邻位羟基 ,则可区分矢车菊素、 牵牛色素、 飞燕草素 (有邻位羟基 )与天竺葵素、 芍药
色素、 锦葵色素 (无邻位羟基 )。
② 糖基位置的确定  糖基化会导致可见光区紫移 , 3 - 羟基位的糖基化会导致紫移 (约 10 - 15
nm) , 5 -糖基化会紫移约 7 nm. 3, 5 -糖基化的花色苷与只 3 -羟基位糖基化的同花色素的花色苷不易区
分 ,但 5 -羟基的糖基化与酰基化会在 400 - 570 nm处产生不同的吸收值. 5 -羟基的没有糖基化 ,只是 3 -
羟基位的糖基化有一个肩峰 , 5 -羟基的糖基化会在这个区域产生一个平台.糖基位置的确定方法就是
测定 E440 nm /Emax
[ 13 ]
.
③ 酰基是否存在的确定   测定在 300 - 330 nm范围内有无吸收峰 ,若有则说明有酰基. pH > 0 . 4时 ,复
合酰化的花色苷在 560 - 600 nm或 600 - 640 nm还显示一个额外的吸收峰[ 3 ]
.
④ 甲基化与羟基化   花色苷 3’ 和 5’ 位置的羟基的甲基化会导致微量的紫移 ,但 7 -羟基的甲基化会导
致 8—10 nm的紫移 (伴随颜色变红 ).分子内羟基数目增多会导致红移 (颜色变紫 ).
⑤ 其它   添加甲醇钠 (NaOMe)若可见光区的吸收波长红移 ,且吸光度值不随时间下降 ,则说明花
色苷 4’ 位有羟基 ,且 3位羟基上形成糖苷[ 10 ]
.若花色苷在紫外光下有荧光则说明 5位有取代基[ 10 ]
.当黄烊
阳离子在 4位上有苯基或甲氧基时 ,通入二氧化硫后不会褪色[ 10 ]
.
4 . 3 HPLC (高效液相色谱 )
HPLC可用于花色苷的定性和定量测定 ,但由于商业上可提供的花色苷标准物有限 ,所以限制了 HPLC
在花色苷定性方面的应用[ 11 ]
.再加上高效液相色谱仪本身存在的缺点 ,所以通常采用高效液相色谱仪与质
谱、 核磁共振仪等连用的方法.
4 . 4  花色苷的水解
将花色苷水解后 ,分别测定它的色素元、 糖基和酰基再结合花色苷测定的结果 ,同样可推测花色苷的种
类.常用的方法为:在色素的甲醇溶液中按 1∶ 1加入加入 2mol /L盐酸 ,水浴回流 ,再用戊醇提取色素元 ,以
N -甲基双辛胺的氯仿溶液除去酸 ,浓缩干燥可得酰化剂样品;除去色素元和酰化剂的溶液以氯仿除去多余
的胺 ,浓缩经过微孔过滤器 ,可用于分析。
5  花色苷的定量测定
5 . 1  应用朗伯
C为色素的浓度; E为所测得的消光值; V为稀释倍数;M为标准色素的相对分子量;ε 0为标准色素的分
子消光系数[ 2 ]
.
该方法测定花色苷总量需要在一个恒定的 pH介质中进行.首先要在定性的基础上确定花色苷的种类,
然后测定单个花色苷的吸收波长下的摩尔消光系数ε或比消光度 E.但单个花色苷的差别很小,而且单
个花色苷组成的比率未知,所以一般用平均比消光度 av E来测定花色苷总量,误差小于 0 . 2%.单个花色苷
的比消光度 E是很难得到的,可以利用参考文献提供的数据. Fuleki和 Francis利用该方法对红莓子中花色
苷总量进行了测定[ 1 ]
.陈炳华、 陈前火等用改进的 Fuleki法测定了果实中花色苷的含量。
5 . 2  经过加工或储藏的材料中花色苷总量测定的两种方法
经过加工或储藏的材料会产生褐色降解物 ,这些降解物和花色苷具有相同的能量吸收范围.这类花色苷
总量的测定 ,通常有两种方法.
5 . 2 . 1 pH示差法
依据花色苷发色团的结构随 pH而转换,而超干扰作用的褐色降解物的特性不随 pH而变化,通过实验确
定两个对花色苷吸光度差别,但对花色苷稳定的 pH值,根据 Fuleki的公式可以计算出花色苷总量[ 1 ]
.
5 . 2 . 2  差减法
先测定样品在可见光区吸光度 ,经二氧化硫或亚硫酸盐漂白或过氧化氢氧化后 ,再测定一次吸光
度 ,二者的差值就是花色苷的吸光度.参考用标准花色苷绘制的工作曲线 ,将吸光度换算成浓度.差减法使用
漂白剂因而能降低某些干扰组分的吸光度而使总花色苷浓度偏高。
5 . 3  单个花色苷的定量分析
对于单个花色苷的定量分析 ,其分离纯化是关键.早期单个花色苷纯化的方法有乙酸铅法、 聚酰胺法、 聚
乙烯吡咯烷酮法和离子交换树脂法等 ,其中以离子交换树脂法*佳. Amberlite CG - 50离子交换树脂比较常
用.日前 , HPLC方法广泛地应用于总花色苷和单个花色苷的定量分析.
6  结束语
近年来 ,随着人们对人工合成色素毒性及花色苷抗氧化性和生理功能的认识 ,对天然色素的需求量将会
越来越大 ,因此找到一种花色苷含量较多且其稳定性较好的植物、 进一步改进花色苷分离提纯的方法使其应
用于生产实践将是花色苷研究的重要方向.

原创作者:杭州瑞析科技有限公司

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