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分析亲水气单胞菌外毒素高分子色谱,凝胶色谱填料

发布时间:2011/5/26 14:32:48阅读人数:1559

高效液相色谱仪色谱填料分析:分离亲水气单胞菌外毒素的功能高分子凝胶色谱填料

曾庆冰 , 许 家瑞 , 符若文, 叶巧真
中山大学生命科学院材料科学研究所, 广东 广州  5 1 0 2 7 5 
教育部聚合物基复合材料与功能材料重点实验室
摘要  由丙烯 酰胺 和甲叉丙烯 酰胺 在水 油悬 液中共 聚得 到聚丙烯 酰胺凝胶 Z S P, 并用 I R、 溶
剂吸收 实验等对合成 的 Z S P的结构进 行了确证 。以商 品葡聚糖凝 胶色谱 S e p h a d   d e x — G1 0 0为对
照 , 研究 了 ZS P 一 1 0对 中华鳖致 病的亲水气单 胞菌外毒素蛋 白的分 离性能 , 结果 表明经 S e p h a d e x — 
G1 0 0和 Z S P一 1 0提纯的外毒素蛋白均保留了生物活 ( 毒) 性 , 纯度高 。 从 S DS — P AGE分析结果 , 可以
认为经提纯的毒素蛋 白是分 子量 为 3 2 KDa的纯品。与 S e p h a d e x — G1 0 0凝胶相 比, 聚丙 烯酰胺凝胶
色谱填料 Z S P一 1 0对 蛋 白质 的回收率更 高, 且成本低廉 , 不易染菌 , 是具有 良好 的应 用前景 的蛋 白
质分离色谱填料。 
关键词 : 亲水气 单胞菌外毒素  聚丙烯酰胺凝胶
1   前言
在生物技术制取蛋 白质 的多级纯化过程
中, 液相色谱被指定为一个必须步骤 , 这表明操
作条件温和、 又具有分子水平分离能力的液相
色谱为开创现代生物大分子化学树立了一个里
程碑。在液相色谱 中, 无论是哪一种层析方法 , 
分离介质 的性能都是分离效果 的首要决定 因
素。目前所使用的多糖类蛋白色谱分离存在的
普遍存在易染菌、 回收率低 、 成本高等问题 。开
发高效的蛋 白分离介质受到国内外学者的广泛
关注。蛋白分离层析介质 的发展趋势可以认为
是对以天然大分子为母体 的层析介质不断地进
行合成工艺改进 , 提高性能 , 使老产品更新换
代; 同时大力开发以合成高聚物为骨架 的具有
优异性能的新一代产品。 
亲水气单胞菌在 自然界尤其在水体环境中
分布甚广, 属弧菌科, 能引起人和动物的多种疾
病n   , 特别是水生动物暴发性传染病 , 此病在我
国东南各地广泛流行 , 尤 以水温较高的夏秋季
为剧, 导致水生养殖鱼类大量死亡, 给渔业生产
造成重大经济损失 矗   。 
亲水气单胞菌在习惯上被认为是条件致病
菌 , 随着细菌本身的研究的深入 , 这一认识正在
被修正 。已有报道该菌的 O抗原、 菌毛及一些
表 面的非特异性粘附因子与该菌的致病性有
关“   。 然而, 更多的报道指出致病侏能产生细胞
外毒素 , 而毒素与致病关系密切 ~ 7   。 但是关于
毒素的种类和性质诸说不一 , 未有定论。 我们用
自制的凝胶色谱介质对 中华鳖致病的亲水气单
胞菌素进行了分离。 
2 实验部分
2 . 1 菌种
亲水气单胞菌菌株从广东省东莞市某养殖
场患病的中华鳖中分离鉴定, 取材选取濒死新
本研究由国家 自然科学基金委杰 出青年科学基金资助( 项 目编号 : 5 9 6 2 5 3 0 7 ) 
2 . 2 细菌培养
亲水气单胞菌菌株接种合成培养基 中, 摇
床培养 3 5 ℃, 1 0 0   r / mi n, 2 4   h。 培养物经 4_ C, 1 O 
0 0 0   r / mi n离心 3 0   mi n , 取上清液。 将此上清液
对小 白鼠( 体重 1 8 ~2 2   g ) 腹腔进行注射( 剂量
为 0 . 4   ml / 只) , 确证其生物活性 。 
2 . 3   聚丙烯酰胺凝胶色谱填料 Z S P的合成
在 甲 苯 和 三 氯 甲烷 溶 剂 中加 入 少 量
Twe e n 一 8 0和 1   9 / 6 聚乙烯醇 , 滴加丙烯酰胺和甲
又丙烯酰胺水溶液 , 5 0 V水浴恒温 , 滴加完毕待
分散均匀后加入适量过硫酸铵, 待反应完成后 , 
撤去水浴 , 体系 自然冷却至室温, 减压抽滤 , 真
空干燥 , 筛选出 2 0 0 ~3 0 0目产物备用。 
2 . 4   红外分析: 采用布鲁克 EQUI NOX   5 5傅
里叶变换红外光谱仪 , 波数范 围为 4 0 0 ~4   0 0 0 
c m~, 样品采用 KB r压片法进行测试。 
2 . 5 溶剂吸收实验
将干燥至恒重 的 0 . 1 ~0 . 2   g   Z S P聚合物
凝胶置于一特制的底部带有多孔玻璃砂板的试
管中, 在室温下置于溶剂 ( 水) 中浸泡 2 4   h。试
管用橡胶盖密封 , 放到一离心管内, 用 2   0 0 0 ~4 
0 0 0   r / mi n离心 1 5   mi n除去过量的溶剂 , 将带
有溶胀剂的树脂的试管迅速转移到密闭的烧瓶
中称重。溶剂吸收量用 1   g干树脂 吸收的溶剂
重 量来表 示 。 
2 . 6 毒素的提纯
2 . 6 . 1 硫酸铵盐析
用 Na OH调节细菌培养物上清液至 p H   6 , 
再加入硫酸铵至 7 O   的饱和度 , 4 ℃静置 4   h, 
1 0   0 0 0   r / mi n, 4 ℃离心 3 0   mi n, 去上清液, 沉淀
溶于洗脱缓冲液 中, 对相同缓冲液透析过夜 , 将
透析后的样品用 P EG2 0   0 0 0进行浓缩 , 即为粗
提毒素。 
2 . 6 . 2  S e p h a d e x   G一 1 O 0凝胶过滤
将粗提 毒素 于 4 ℃装 S e p h a d e x   G1 0 0柱
( P h a ma c i a产品, 1 . 6×5 0   c m, 平均液及洗脱液
均为 5 0   mmo l / L   Tr i s — HC1 , p H  7 . 8 ) , 流速为 1 2 
ml / h, 每管收集 4   ml , 用紫外检测仪 2 8 0   n m进
行检测, 合并生物活性部分 , 冻干浓缩。 
2 . 6 . 3  Z S P 一 1 0凝胶过滤
将 粗 提 毒 素 于 4 n C装 交 联 度 为 1 O   9 / 5 的
Z S P 一 1 0 柱 ( 自制 , 1 . 6 ×5 0   c m, 平衡液及洗脱液
均 为 0 . 2   mo l / I  Na Ac — HAc , p H5 . O ) , 流速为
1 2   ml /· h, 每管收集 4   ml , 用紫外检测以 2 8 0 
n m进行检测 , 合并生物活性部分, 冻干浓缩 。 
2 . 7   SDS— PAGE
采 用 La e mml i 不 连续 S DS — P AGE系统 , 
按常规方法在小型蛋白电泳仪上进行 1 0 0   V恒
压电泳约 3   h。 所用分离胶浓度为 1 2   9 / 6 , 浓缩胶
浓度为 4   9 / 6 , 用考马斯兰法染色。 
2 . 8 小 白鼠毒性试验
小 白鼠体重 1 8 ~2 2   g, 每组 2只, 分别腹腔
注射 0 . 4   ml 毒素样品。 
3 结果与讨论
3 . 1  I R分析
图 1   聚丙烯酰胺凝胶填料的 I R谱图
图 1是 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 渗 透色 谱填 料  而引起的。 3 1 8 8   c m 处的强峰是 N— H伸缩振动
Z S P 一 1 0的红外谱图。3 3 9 4 c m 处宽而强的峰是  吸收峰。 2 9 3 2   c m  和 2 7 8 1   c m  处的强峰是 CH

OH伸缩振动的谱带 , 由样 品中残留水分存在  基团中不对称和对 称 C— H伸缩振动峰。1 6 6 3 

1 9 —  
CHI NES E   J . DI Al   . & ARTI F. ORGANS   Vo 1 . 1 4   No . 1   Ma r c h, 2 0 0 3 
c m。 处的强峰是 C=0伸缩振动吸收峰。1 4 0 0 
c m~, 1 3 0 0 c m~, l l 0 0 c m 和 1 0 0 0 c m。附 近的峰
是 C— N伸缩振动和一 NH变形振动引起的。6 2 7 
c m  处的峰是 N— H面外变形吸收峰。 
3 . 2  Z S P树脂的吸水率
图 2是 Z S P树脂吸水率一交联度曲线。 很
明显, 在交联度为 5   ~2 0   的范围内树脂 的
吸水率与交联度成正 比。 由此可推测, 在所合成
的聚合物中交联点的分布是 比较均匀的。 
O0   5 .o o%   I o. 00 %   l 5 . O0 %  2 0. o(   2   5 |t ) 儡 
空娃度
图 2  Z S P树脂吸水率一 交联度 曲线
3 . 3 毒素的纯化
粗提毒素经 S e p h a d e x- -Gl O 0凝胶色谱柱
纯化后 回收率为 1 8 . 8 3   , 经交联度为 1 0   的
聚 丙 烯 酰 胺 Z S P 一 1 0柱 纯 化 后 回 收 率 为
6 8 . 0 5   , 洗脱液蛋峰分别为图 3和图 4 。上样
后 S e p h a d e x a —G1 0 0湿凝胶 在 4 ℃只能保 存
■ d ■’ h● ¨
图 3 毒素的 S e p h a d e x — G   1 0 0层析
3 . 4   SDS— PAGE
经 S e p h a d e x—G  1 0 0和聚丙 烯酰胺 Z S P一 
1 0柱纯化后的毒素进行 S DS — P AGE, 考马斯兰
图 5   S e p h a d e x纯化 S DS — P AGE 
行 M: 分子量标准 , 行 A: 
粗提毒素 . 行 B: 提纯毒素
1 0天左右即会滋生霉菌, 不能再重复使用。而
Z S P 一 1 0 在 同样的条件下可保存半年。 提纯毒素
经浓缩后注射小 白鼠, 2 4   h后小 白鼠死 亡, 可
以认为两种凝胶色谱柱均保留了外毒素蛋白质
的生物 活性 。 
图 6  ZS P 一 1 0纯化 S DS — PAGE
行 M: 分子量标准, 行 A; 
粗提毒素 , 行 B : 提纯毒素
4   结论  1
由丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺在水油悬液中
共 聚得 到交 联度 为 1 0   的 聚丙 烯 酰胺 凝胶  ‘ 
Z S P 一 1 0 。Z S P 一 1 0对使 中华鳖致病 的亲水气单
胞菌外毒素蛋 白的分离性能 良好 , 保留了生物  . 
活( 毒) 性, 纯度 高。 从 S D S — P AG E分析结果 , 可
以认为经提纯 的毒素蛋白是分子量为 3 2   KDa   5 
的纯品。与 S e p h a d e x — G1 0 0凝胶相比, 聚丙烯
酰胺凝胶色填料 Z S P一 1 0对蛋 白质 的回收率更  6 
高, 且成本低廉 , 不易染菌 , 是具有 良好的应用
前景的蛋白质分离色谱填料。   7 
参考文献
Ka p p e r   J B, e t   a 1 . J . Ap p 1 . B a c t e r i a l , 1 9 8 4. 5 0 : 3 5 9 ~
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陈怀青 、 陆承平 .南京农业大学学 报 , 1 9 9 1 . 1 4( 4 ): 
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涂小 林 、 陆承平 .微 生物 学报 , 1 9 9 2, 3 2( 6 ) : 4 3 2~
4 3 8 
( 收稿 : 2 0 0 0 — 1 0 — 1 8 ) 
群体反应性抗体( P RA) 高的免疫吸附治疗
于  颖 , 孟 建中
济南 军区总医院血液净化 中心 , 山东  济南 2 5 0 0 3 1 
摘 要  目的 : 研究高群体反应性抗体 ( P RA) 的患者进行 肾移植, 术后常发生超急性 ( HAR) 
或急性排斥 ( AR) 反应 , 导致移植肾功能 丧失 。方 法; 1 8例 PRA高的患者行免疫吸附 ( 1 A) 治疗
前血液透析 1 ~6年。8例第 2次肾移植 , 3例第 3次肾移植 。P RA  2例>7 O   , 5例 >5 O   , 5例
>3 O   , 6例>2 O   。 采 用 日本 p l a s a u t o — l Q免疫吸附系统机进行 免疫 吸附治疗 。 结果 ; 1 8例 P RA
高 的患者行 l A 治疗 3 ~8次后 , 复查 PRA. 9例为 0 , 6例<5   , 3例 <1 O   , 都 达到了治疗效果 。 
结论 : P RA 的检测对提 高肾移植 成功率和存活率具有实际意义 . 移 植后未发生 HAR和 AR, 为
患者解决 了因 PRA 高而不能 肾移植 的难题 。 
关键词 : 群体反应性抗体 免疫吸附治疗  肾移植
肾移植是治疗慢性肾功能不全终末期肾衰
的主要方法, 若移植后的肾功能恢复正常, 
其发挥的作用远大于任何类型的透析。肾移植
的优势还在于能使患者骨髓代谢恢复正常 , 消
除贫血, 并能正常生活与工作。 而群体反应性抗
体( P RA) 高的患者进行 肾移植, 术后常发生超
急性 ( HAR) 或急排 斥 ( AR) 反应, 导致移植 肾
功能丧失 , 甚至危机患者生命 。为解决这一难
题, 我院 自2 0 0 1年 1月至今, 为 1 8例患者行免
疫吸附( I A) 治疗疗效显著 , 现总结如下 。 
1 资料与方法
1 . 1 一般资料
我院 自2 0 0 1年 1月至今为 1 8例 PRA高
的患者行免疫吸附( I A) 治疗 , 男性 1 1例, 女性
7例 , 年龄 1 8 ~6 5岁。 9例原发病均为慢性肾小
江苏舜星科技有限公司 www.shunstar.com.cn

原创作者:杭州瑞析科技有限公司

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